Chemistry | Biochemistry » A szukcinát-dehidrogenáz gátlása malonsavval

BIOKÉMIA II – GYAKORLAT A szukcinát-dehidrogenáz gátlása malonsavval  Enzimek kompetitív gátlása     Kompetitív gátlás esetén a gátlószer olyan vegyület, ami szerkezetileg hasonlít a szubsztrátra. A szabad enzimhez kötődve megakadályozza a szubsztrát kapcsolódását, mintegy verseng a szubsztráttal az enzimhez való kötődésben. A szubsztrátkoncentráció emelésével a gátlás kivédhető. A kompetitív inhibitor hatására látszólag csökken az enzim affinitása a szubsztráthoz, tehát a K M érték nő. A v max nem változik, mivel az ES-komplex kialakulása gátolt, de elbomlása nem! KM  ([ E ]  [ ES ])  [ S ] [ ES ]  Ha a hányadosban az ES mennyisége csökken, mert az enzim egy része EIkomplexet képez, a tört értéke, azaz a K M nő.  Látszólagos kompetitív gátlás esetén, az inhibitor nem az enzim aktív

centrumához kapcsolódik, hanem valamely más csoportjához, és az enzimfehérje harmadlagos szerkezetének megváltoztatásával gátolja annak szubsztrátkötő képességét. Kinetikailag nem különböztethető meg a valódi kompetitív gátlástól. Az allosztérikus gátlások egy része is ilyen.   A szukcinát-dehidrogenáz   A szukcinát-dehidrogenáz a citrát-ciklus egyik enzimje, ezért aktivitásának fokozása vagy gátlása közvetve befolyásolja a metabolitok többségének lebontását. Az enzim kofaktort használ a katalízis során, ami nem más, mint FAD, ami a reakció során FADH 2 -vé redukálódik: szukcinát + E-FAD  fumarát + E-FADH 2  Az enzim a mitokondrium belső membránban lokalizálódik, amely mikroszómahomogenizátumban szem veszíti el aktivitását.  Kivitelezés  Az enzim a szukcinátról átvett hidrogént aktivitásának mértékében képes megfelelő redox festéknek átadni: E-FADH 2 + oxidált festék 

E-FAD + redukált festék BIOKÉMIA II – GYAKORLAT  Az oxidált festék színtelen, míg a redukált festék piros színű. A festék nem autooxidábilis.  Készítünk egy vakmintát, amiben mitokondriummembrán (E), puffer, szukcinát (S) és oxidált festék van, valamint a reakciót azonnal leállító FTF (formiát-tritonformalin). Készítünk egy hígítási sort, amelyben egyre nagyobb koncentrációban van jelen a szukcinát (S), és nincs a mintában malonsav (I), valamint FTF. A többi komponens megegyezik a vakkal. Készítünk egy hígítási sort, amelyben minden megegyezik az előző sorral, de ebben jelen van a malonsav (I) is.      Az elegyeket 10 percen át 37 oC-on inkubáljuk, majd FTF-fel az összes mintában leállítjuk a reakciót. A mintákat 490 nm-en fotometráljuk, amikor is az extinció arányos lesz a redukálódott festékkel, tehát

közvetve magával a produktummal, a fumaráttal. A Lambert-Beer törvény segítségével adott ε ismeretében produktum koncentrációt számolhatunk: lg I0  εd c I OD  c   d t c OD  A t  d  Az aktivitást koordinátarendszerben ábrázolva, akár a MM-kinetika alapján, akár a reciprokábrázolással igazolhatjuk, hogy a malonsav gátolja a szukcinátdehidrogenázt, ráadásul mivel a K M érték nő, a v max nem változik (grafikus ábrázolásból leolvasható) a gátlás kompetitív volta is igazolt