Agricultural science | Farming » Dr. Mosonyi István Dániel -Dísznövények mikroszaporítása

Dísznövények mikroszaporítása 2017.0218 Dr. Mosonyi István Dániel A mikroszaporítás fogalma, jelentősége Szelektált fajok illetve fajták vegetatív, fajtaazonos szaporítása in vitro (steril laboratóriumi) és kontrollált körülmények között. ELŐNYÖK HÁTRÁNYOK Kis helyigény Fertőződés léphet fel Hatóságilag igazolható kórokozómentes Szomaklonális variabilitás léphet fel Nincs visszafertőződés Akklimatizációs veszteség nagy Homogén minőség Nagy költségigényű Évszaktól, éghajlattól független Speciális laborhátteret igényel Folyamatos előállítást tesz lehetővé Képzett munkaerőt igényel Nehezen szaporítható fajoknál is jó Új genotípusok gyors felszaporítása Gépesíthető és automatizálható Különösen gyors módszer A tenyészetek könnyen szállíthatók A mikroszaporítás fogalma, jelentősége Dísznövények, gyümölcsök Kína: erdészeti fajok Izrael: szegfű, krizantém,

gladiólusz Arab országok: datolya, banán, burgonya, szamóca, pisztácia, rózsa India: főleg fásszárúak, dísznövények, banán A világon évente 700 millió növényt állítanak elő in vitro (2003-as adat). Cserepes dísznövények mennyisége a holland virágtőzsdén 120 Phalaenopsis Anthurium növényszám (millió db) 100 Kalanchoe Rosa 80 Hyacinthus Chrysanthemum 60 Dracaena Ficus 40 Spathiphyllum Cyclamen 20 0 Begonia Poinsettia 2005 2006 2007 2008 2009 2010 Dugványozás vs. mikroszaporítás afrikai ibolya esetében Cél: 10 000 db növény Levéldugványozás Mikroszaporítás Szükséges anyanövények száma (4-5 db levél/növény) 667 db 3 db Helyfoglalás a növényházban 17 m2 0,08 m2 Szaporodási ráta levelenként 3× 810× Munkaigény 13,2 h 137,8 h A mikroszaporítás elméleti háttere Növényi sejtek totipotenciája – a növény testi sejtjeinek mindegyike megtartja azokat az információkat, ami

alapján egy sejtből felépülhet egy teljes növényi szervezet (totipotens = mindenre képes) Gottlieb HABERLANDT 1902-ben fogalmazta meg a totipotencia elvét (Kulturversuche mit isolierten Pflanzenzellen, Sitzungsber. Akad Wiss Wien MathNaturwiss Kl, Abt J 111, 69–92) A bizonyításra 1958-ban került sor, STEWARD által. Sárgarépánál már differenciálódott sejtekből kalluszt állítottak elő, valamint megfigyelték, hogy ennek a kallusznak egyes sejtjeiből nem csak szerveket (organogenezis), hanem embriókat is lehet fejleszteni (embriogenezis). NÖVÉNY – SEJT – NÖVÉNY rendszer dedifferenciálódás - redifferenciálódás A mikroszaporítás szakaszai Előkészítés Steril kultúra indítása Felszaporítás Elongálás és gyökeresítés Akklimatizálás 0. – Előkészítő szakasz Célja: a sterilizálás megkönnyítése, az osztódó szövettájak aktivizálása Alkalmazott módszerek: • a szár lelevelezése indítás előtt 1-2 héttel

(sebforradás) • átállás felszívatásos öntözésre 2-4 hónappal indítás előtt • a hajtáscsúcs eltávolítása 2-4 héttel indítás előtt (oldalrügyek megduzzadnak) • magasabb hőmérsékleten illetve fényen nevelés • citokininnel való kezelés Hemerocallis anyanövények Az indítás előtt a virágzati szárak megnyúlása már a laboratórium steril környezetében történt. Juvenilis részek fás növények esetében: George et al., 2008 Az előkészítő szakasz A rejuvenizálás módszerei: - visszavágás, sérülések okozása - etiolálás - hormonkezelés – citokininekkel többnyire kapcsoltan egy fizikai kezeléssel (utána) A dormancia megszüntetése: - magok/rügyek esetében GA kezelés (in vitro is lehet – alvó rügyeket könnyebb sterilizálni)  akár közvetlenül lehet őket alkoholba mártás után lelángolni - hőkezelések (hideg/meleg) – hagymák, évelők stb. Fenyők rejuvenilizálása sorozatos átoltással:

George et al., 2008 1. – Indító szakasz Explantátum (inokulum) – kiindulási növényrész kiválasztása Szinte bármelyik rész lehet – de célszerű olyat választani, ami merisztémát tartalmaz, vagy merisztémadifferenciálásra hajlamos. Hajtáscsúcs Bimbó Felleveles virágzati szár Hónaljrügy Levél Nódusz Száraz buroklevél Húsos buroklevél Csúcsrügy Hónaljrügyek Mag Tönk Gyökerek 1. – Indító szakasz Célja: a steril körülmények létrehozása és fenntartása Alkalmazott módszerek: • eszközök és edények sterilizálása: hőlégsterilezés (120-180°C) vagy gáz alkalmazása (formaldehid, etilén-oxid) • táptalaj sterilizálása autoklávozással (15-30 min, 121°C, 0,1 MPa túlnyomás) • explantátum fertőtlenítése: •Csapvizes mosás •Etanol 70% •Na vagy Ca-hipoklorit (NaOCl, Ca(OCl)2) 2-10% •Higany(II)-klorid (HgCl2) 0,1% •Öblítés steril desztillált vízzel • táptalajra helyezés steril fülkében

– lamináris box Kombinálhatók 1. – Indító szakasz Felleveles virágzati szárdarabok – alvórügyet tartalmaznak a fellevél tövében Csapvizes előmosás 1. – Indító szakasz Áztatás a fertőtlenítőszeres oldatokban – keveréssel kombinálva A sterilitás biztosítása 1. – Indító szakasz Az indítási szakasz táptalajai Az inokulum típusától függ. Általában az ásványi elem összetétel ua., a növekedésszabályozók a különbség Merisztémacsúcs tenyészet: Hajtáscsúcs tenyészet: In vitro magvetés: sokszor elegendő az auxin egyedül auxinként IVS, NES, de 2,4-D nem citokininként: BAP, KIN, 2-iP, TDZ nem kell növ.szabályzó, bár a citokininek a csírázó embrióknál hajtástöbbszöröződést tudnak indukálni (Mimulus, Petunia, Sinningia, Citrus) gibberellinek a magnyugalom megtöréséhez Az indítási szakasz problémái Barnulás: Oka: sebfelületen barnul/feketedik a növényi szövet, később

a táptalaj is elszíneződhet. a fenolázok, mono- és polifenoloxidázok, felszabadulnak a sejtmembránokból, ezek szubsztrátjai (hidroxifenolok) pedig a vakuólumokból és reakcióba lépnek egymással polifenolok, kinonok keletkeznek, és fehérjékhez kötődnek, vagy oxidálják őket -> toxikusak Megelőzése: - a sérülések minimalizálása - a fenolos vegyületek eliminálása - öblítés, mosás, kiáztatás - táptalaj gyakori cseréje (naponta, hetente) - folyékony táptalaj használata (jobb diffúzió) - aktív szén vagy PVP(P) használata lekötéshez - a fenoláz enzimek inhibitálása kelátképzőkkel - a fenoláz aktivitás csökkentése (alacsony pH, hőm.) - áztatás antioxidánsban (citromsav, aszkorbinsav) - antioxidánsok adása a táptalajhoz Spathiphyllum torzsavirágzat, mint explantátum 2. – Felszaporítási szakasz Cél: a tenyészet sokszorozása A táptalaj általában citokinin túlsúlyos, arányaiban kevesebb auxint

tartalmaz. A szaporodási ráta mutatja a szakasz hatékonyságát: egy szubkultúrálás alatt fejlődött továbbszaporításra alkalmas új részek (sarjhagyma, sarjhajtás) száma egy explantátumra vonatkoztatva. A felszaporításnak több útja lehetséges. A mikroszaporítás lehetséges útjai Egy- vagy többrügyes hajtásdarabbal Oldalhajtással Járulékos hajtással Járulékos szervvel Sejtszuszpenzióban Hajtástenyészetben A merisztémából fejlődő hajtás egy- vagy többrügyes darabjainak átoltásával. A merisztémából fejlődő hajtás oldalhajtásainak átoltásával. A merisztémából fejlődött kalluszból regenerálódott hajtások átoltásával. Szomatikus embrióval Hajtáseredetű szervek (gumó, hagyma) indukciójával. Sejtszuszpenzióban fejlődött szomatikus embriókból készített mesterséges magvakkal. A szaporítás lehetséges útjai a sokszorosító szakaszban George et al., 2008 A hajtáscsúcskultúra

(hajtáscsúcsból és oldalhajtásból) George et al., 2008 A hajtáscsúcskultúra (hajtáscsúcsból és oldalhajtásból) Elsődleges explantátum: - merisztéma - száron lévő rügyek (csúcs- vagy oldalrügyek) - hajtás (20 mm-ig) – főleg lágyszárúaknál előnyei: könnyebben megindul több rügyet tartalmaz könnyebben túlél hátrány: vírusfertőzött lehet nehezebb sterilizálni Fásszárúaknál problémák: - egyes rügyekben nagy a mikrobiális szennyezettség - sokszor fenolosodási probléma lép fel - dormancia előny: - a rügyeket könnyű felszínileg sterilizálni Táptalaj: citokinin-túlsúlyos (apikális dominancia gátlása – kivéve pl Gymnocladus spp.) Hajtások eredete szerint válogatni, ugyanis előfordulnak járulékosan fejlődöttek is! Kalluszosodás megelőzése: auxin-inhibitorokkal (TIBA, transz-fahéjsav) A nóduszkultúra (egy- vagy többrügyes szárdarabokkal) George et al., 2008 A nóduszkultúra (egy- vagy

többrügyes szárdarabokkal) Elsődleges explantátum: ua. mint a hajtáscsúcskultúránál Nevelés: 5-10 cm-es méretig, amíg a nóduszok jól elkülönülnek Táptalaj: citokininmentes általában (nem kell elágazás!) esetleg GA használata a megfelelően megnyúlt hajtásokhoz Alkalmazás: burgonya, Alstroemeria főleg Szaporodási ráta általában kisebb, mint a hajtáscsúcskultúránál, de kevesebb kallusz fejlődik, és kevesebb adventív hajtás  genetikai stabilitás nagy A nóduszkultúra (egy- vagy többrügyes szárdarabokkal) Egyszikűek Fásszárú kétszikűek Alstroemeria Carpinus betulus Cymbopogon spp. Castanea sativa, C. mollissima Poa pratensis Eucalyptus grandis Asparagus officinalis Forsythia ovata Dioscorea spp. Fraxinus pennsylvanica Zea mays Juglans regia Orchideák Hevea brasiliensis Dendrobium spp. Leucaena leucocephala Phalaenopsis spp. Ligustrum obtusifolium Thunia alba Lonicera periclymenum Vanilla planifolia Olea

europea Lágyszárú kétszikűek Paulownia tomentosa Angelonia salicariefolia Poncirus trifoliata Cucumis sativus Prosopis juliflora Glycyrrhiza glabra Prunus armeniaca Rosmarinus officinalis Quercus robur Rorippa nasturtium Salix spp. Solanum tuberosum Syringa spp. Járulékos hajtáskultúra – direkt organogenezis Nevezik adventív hajtáskultúrának vagy járulékos rügyindukciónak is. Nem meglévő rügyekből fejlődik a hajtás, de nem is kalluszból. (Kalluszfejlődés viszont előfordulhat a direkt morfogenezissel EGYIDŐBEN). Csak erre hajlamos fajoknál, genotípusnál működik, egyes növényeknél soha. Elsődleges explantátum: levélszövet, szárszövet, virágszirom, gyökérszövet egyes növényeknél korlátozódik: hagymalevélre, magoncszövetre Előnye: gyorsabb és könnyebb megindítani a szaporodást (Saintpaulia merisztéma kioperálás  virágzati szárdarab) Alkalmazás: levéldarabokból szárdarabok, virágzati szár

Gyökerek Achimenes Kaktuszok Cichorium Saintpaulia Gerbera Armoracia Sinningia Hosta Convolvulus Streptocarpus Lilium Taraxacum Begonia Hemerocallis Epiphyllum A kalluszból kiinduló hajtáskultúra (indirekt organogenezis) George et al., 2008 Járulékos szervkultúra Számos haszon- és dísznövényt szaporítanak hajtáseredetű raktározó szervvel. Ezek in vitro is működő módszerek: hagymával: amarillisz, jácint, liliom, vöröshagyma, nárcisz hagymagumóval: kardvirág minigumókkal: burgonya, jamszgyökér, kúszóliliom (Gloriosa) Hajtáseredetű szervek, rügyekből és járulékosan is fejlődhetnek. Magas citokininszint szükséges. Továbbszaporítás: szervekkel Előny: nem kell akklimatizálni! Szomatikus embriogenezis Kiindulás: szomatikus sejt Fejlődés: - direkt embriogenezis (az embrió közvetlenül a testi sejtből keletkezik) - indirekt embriogenezis (először több, nem embriogén mitotikus sejosztódási ciklus

előzi meg a felismerhető embriogén struktúra kialakulását) - Az embrió csírázásához pontosan meghatározott környezeti feltételek szükségesek - Folyékony táptalaj szükséges a neveléshez - Bioreaktor rendszerekhez ideális ÜZEMILEG NEM NAGYON ALKALMAZZÁK! Néhány elérhető technológia: Chrysanthemum grandiflorum Cyclamen persicum Euphorbia pulcherrima Rosa sp. Saintpaulia ionantha Oncidium ‘Sugar Sweet’ PLB-k (protocorm like body) szuszpenziós tenyésztése A sokszorosító szakasz problémái - Citokininfelhalmozódás (gyökeresedésgátlás, bokros növekedés) - Szaporodási ráta csökkenése (citokinin-hozzászokás) - Genetikai variabilitás - Hiperhidratáció (korábbi nevén vitrifikálódás) Tünetek: - rövid internódiumok - duzzadt szövetek - halványzöld, esetleg fehér szín - üvegszerű, áttetsző részek - szalagosodott szár, levél - csavarodott, deformált habitus Előfordulás: - hajtáskultúrában -

nóduszkultúrában - kalluszkultúrában különösen hajlamosak: - fásszárúak - Caryophyllaceae A hiperhidratáció A ligninbioszintézis csökkenése miatt az edénynyalábok és tracheidák hiányoznak, vagy abnormális alakúak a szárban és a levelekben. A sejtekben kevesebb a cellulóz – a sejtfal kevésbé áll ellen a nyomásnak. Sok vizet vesz fel, megduzzad, deformálódik. Továbbá csökkent a protein- és klorofillszintézis. Befolyásoló tényezők: - magas hőmérséklet, alacsony fényintenzitás/sötét - magas relatív páratartalom a növény körül - magas hormonkoncentráció Megelőzése: - a páratartalom csökkentése - szellőztetés, lezárás megváltoztatása - lombikok aljának hűtése harmatpontig - a táptalaj párolgásának csökkentése (lanolin, vagy ozmotikum használatával) - a táptalaj NH4+ koncentrációjának csökkentése - az agar vagy szacharóz koncentrációjának növelése - áthelyezés hormonmentes táptalajra -

floroglucinol, floridzin használata (a ligninbioszintézis prekurzorai) 3. – Elongációs és gyökeresítési szakasz Elongáció – megnyújtás Rejuvenilizáció miatt kisméretű növények – életképtelenek a lombikon kívül Módszerei: -áthelyezés citokininmentes táptalajra -a hormonok lekötése a táptalajban: folyékony táptalajt rétegeznek a szilárd, szaporító táptalaj tetejére 3. – Elongációs és gyökeresítési szakasz Gyökeresítés – a rejuvenilizált növények általában jól gyökeresednek Lehetőségek: In vitro Ex vitro -jobban kontrollálható, de költségesebb is -a gyökértelen hajtásokat minidugványként kezelik -talajba helyezéskor viszont az in vitro fejlődött gyökerek egy része elpusztulhat, a gyökeresedés kis időre megáll -költségkímélő -érzékenyebb növényeknél -a gyökeresedés beindításához auxinos oldatba mártják a növényeket, de nem feltétlen szükséges George et al., 2008

4. – Akklimatizációs szakasz Szoktatás a lombikon kívüli világhoz. Üvegházi körülmények között – ahol lehet szabályozni a környezeti paramétereket. Az in vitro fejlődött növények érzékenyebbek: •az epidermiszen a kutikula vékonyabb •sokszor hiányzik a viaszréteg •a sztómák nem eléggé funkcióképesek, nyitva vannak folyton •a mezofillumban az oszlopos parenchimasejtek kicsik, egyrétegűek Fontos a magas páratartalom biztosítása, és az erős fény leárnyékolása. A folyamat általában 4 hétig tart, ez alatt a páratartalmat fokozatosan kell csökkenteni, az árnyékolást pedig megszüntetni. 4. – Akklimatizációs szakasz -A táptalaj lemosása a gyökerekről -A túl hosszú leveleket vissza kell kurtítani -A gyökerek megmetszése segíti azok elágazódását -A növénykék beültetése az akklimatizáló közegbe: A közeg kórokozó és kártevőmentes legyen, jó vízáteresztő: pl tőzeg és perlit keveréke

4. – Akklimatizációs szakasz Fitotron (növénynevelő kamra) -megfelelő környezet biztosítása. 18-30°C között – fajtól függően kezdeti 80-90% RP – majd csökkenteni fényintenzitás alacsony – később növelni A táptalaj Biztosítja a tenyészet számára szükséges: -tápanyagokat (makro- és mikroelemek) -energiaforrásokat (a fotoszintézis csökkent üzemmódban megy!) -növekedésszabályozó anyagokat (hormonok) -egyéb anyagcsere termékeket, melyet a növények in vitro nem tudnak előállítani (egyes vitaminok) A táptalaj halmazállapota lehet szilárd és folyékony. szilárd táptalaj - egész növényt, szervet (hajtásokat) nevelünk rajta folyékony – sejt- és szövetkultúrákhoz alkalmazható jobban A táptalaj összetevői 1. Makro- és mikroelemek makro: N,P,K és Ca, Mg (szervetlen sók formájában) konc.: 15 - 2000 mg/l mezo: Fe (szerves komplex só formájában – Na-Fe-EDTA) mikro: Co, Cu, B, I, Mn, Mo, Zn konc.: 0,002 –

40 mg/l 2. Szénhidrátok mint energiaforrások konc: 0,5 – 3 % egyszerű cukrok: glükóz, fruktóz összetett cukrok: szacharóz cukoralkoholok: szorbitol, mannitol – csak Rosaceae hasznosítja! szénhidrátok másik szerepe: ozmotikus regulánsok 3. Vitaminok konc.: 0,1 – 2 mg/l Elsősorban a B csoport vitaminja fontosak: B1 (tiamin), B3 (nikotinsav), B6 (piridoxin) C vitamin felhasználása antioxidánsként 4. Szilárdító anyagok konc.: 5 – 10 g/l agar (algakivonat), heteropoliszacharidok – pl Gelrite 5. Növekedésszabályozó anyagok – növényi hormonok 6. Egyéb: természetes kivonatok és pufferek (szerves savak) Makroelemek A növények ionos formában veszik fel a makroelemeket: Ca2+ , Mg2+ , K+ , NH4+ , NO3-, HPO42-, H2PO4-, SO42A felvétel történhet passzív és aktív mechanizmussal. A passzív felvétel koncentrációfüggő. Hasonló kölcsönhatások az ionok között a táptalajban, mint in vivo a talajban: IONANTAGONIZMUS - magas K+, Ca2+,

konc. esetén a Mg2+ felvétele gátolt (és vica versa) - magas PO43- konc. esetén a Zn, Fe, Cu felvétele gátolt, a Ca kicsapódhat Makroelemek - Nitrogén 1. Nitrogén A növény számára felvehető forma: - az oxidált forma (NO3-), - a redukált formák (NH4+, R-NH2, R-CO-NH-R’) citromsav almasav fumársav Krebs ciklus cukor Glutamát dehidrogenáz izo-citromsav α-ketoglutársav karboxilátok Szukcinil-CoA NO3- Nitrát reduktáz szervetlen N források NH4+ NO2- Nitrit reduktáz glutamát NH4+ Glutamin szintetáz glutamin -NH2 Transzamináz Glutamát szintetáz egyéb aminosavak szerves N források A növény számára az anyagcserében csak a redukált N formák használhatók! Makroelemek - Nitrogén Az oxidált formájú nitrátion (NO3-) használata mégis elterjedt, mert: - Az NH4+ magas koncentrációja toxikus a növénynek - a nitrátionnak pH-kontrolláló szerepe van a táptalajban, ha nincs puffer A nitrát felvétele csak savas

közegben lehetséges. Nitrát felvétel Ammónium felvétel anion kiválasztás nő a pH proton kiválasztás csökken a pH töltésegyensúly megőrzése a szövetekben! Ha együtt van a táptalajban jelen NO3- és NH4+ akkor: 1. Gyors NH4+ felvétel következtében a pH leesik 4,2 - 4,6-re (5,4-5,8-ről) 2. A további NH4+ felvétele gátolt, de a NO3- felvétele stimulálódik 3. A táptalaj pH-ja nőni kezd Ha csak NO3- van a táptalajban, a szövetekben felhalmozódhat a NO2- a nitritreduktáz gátlása esetén, és mérgezést okozhat. Aminosavak Jó forrásai a redukált N-nek, de használatuk nem általános, mert drágák. Speciális esetek: - orchideamagvak csíráztatása - merisztématenyésztés nem képesek a szervetlen N források felhasználására Biológiailag aktív aminosavak: csak az α-aminosavak L-izomerjei! Alanin, aszparagin, cisztein, glutamin, glicin, arginin, lizin Kazein-hidrolizátum (CH): tejfehérjék savas hidrolízissel lebontva -

olcsóbb, mint a tiszta aminosavak - 18 féle aminosavat (is) tartalmaz - de nem standard az összetétele - 0,1 – 2 g/l koncentrációban Peptonok: kevésbé vannak szétbontva (aminosavak + peptidek, fehérjetöredékek) Makroelemek 2. Foszfor Szükséges: energiatranszferhez (ATP), fehérje és nukleinsavszintézishez Felvétele foszfát ion formában aktív transzporttal (légzési energiát használ) A növényi szervezetben teljesen oxidált formában: ortofoszfátként (PO43-) hasznosul. Felhasznált sók: nátrium és káliumsók 1- és 2-értékű foszfátanionokkal Na2HPO4, NaH2PO4 K2HPO4, KH2PO4 az egyértékű H2PO4- -et jobban felveszi a növény (pH<7 alatt) Magas koncentrációban növekedésgátló hatású (kicsapja a Ca-ot és egyes mikroelemeket, illetve gátolja a felvételüket). Makroelemek 3. Kálium fő szerepe a töltéskiegyenlítés – megmarad kationként a növényben KNO3,K-foszfát sók, KCl formájában 4. Magnézium – klorofill

molekulához, MgSO4 formájában 5. Kén – SO42- formában veszik fel, redukálják –SH, -S-, -S-S- csoporttá relatíve nem érzékenyek a növények a magas S koncentrációra (50 mM-ig) 6. Kalcium – CaCl2, Ca(NO3)2 Murashige – Skoog (MS) Gamborg B5 Schenk & Hildebrandt Makroelem Konc. (mg/l) Makroelem Konc. (mg/l) Makroelem Konc. (mg/l) CaCl2.2H2O 440 CaCl2.2H2O 150 KNO3 2500 KH2PO4 170 KNO3 2500 CaCl2.2H2O 200 KNO3 1900 MgSO4.7H2O 250 MgSO4.7H2O 400 MgSO4.7H2O 370 NaH2PO4.H2O 150 NaH2PO4.H2O 300 NH4NO3 1650 (NH4)2SO4 134 Magas sókoncentráció Közepes sókoncentráció Közepes sókoncentráció Mikroelemek MS (µg/l) Gamborg B5 1. Mangán MnSO4.H2O 22300 13200 2. Cink ZnSO4.7H2O 8600 2000 3. Bór H3BO3 6200 3000 4. Réz CuSO4.5H2O 25 25 5. Molibdén Na2MoO4.2H2O 250 250 6. Kobalt CoCl2.6H2O 25 25 7. Jód KI 830 750 8. Vas Na-Fe-EDTA 37250 28000 9. Nikkel, Alumínium, Nátrium, Klór

Kelatizáló anyagok: EDTA etilén-diamin-tetraecetsav EDDHA etilén-diamin-dihidroxi-fenilecetsav EGTA etilén-glikol-bisz(2-aminoetiléter)-tetraecetsav DTPA dietilén-triamin-pentaecetsav DHTPA 1,3-diamino-2-hidroxipropán-tetraecetsav Növényben MS Hoagland Növényben MS Hoagland (mmol/kg SZA) (mmol/l) (mmol/l) (mol%) (mol%) (mol%) N 1000 60 16 64,4 64,4 53 K 250 20 6 16,1 21,3 19,9 Ca 125 3 4 8 3,2 13,3 Mg 80 1,5 1 5,1 1,6 3,3 P 60 1,25 2 3,9 1,3 6,6 S 30 1,5 1 1,9 1,6 3,3 Cl 3 6 0,05 0,19 6,4 0,17 Fe 2 0,1 0,05 0,13 0,11 0,17 Mn 1 0,1 0,002 0,06 0,11 0,007 B 2 0,1 0,025 0,13 0,11 0,08 Zn 0,3 0,03 0,002 0,02 0,03 0,007 Cu 0,1 0,0001 0,0005 0,006 0,0001 0,002 Mo 0,001 0,001 0,0005 0,0001 0,0011 0,002 Ni 0,001 0 0,0005 0,0001 0 0,002 Na - 0,1 0,05 - 0,11 0,17 totál 15,5 93,7 30,2 100 100 100 Vitaminok A vitaminok a tenyészetek életbenmaradásához

és növekedésük serkentéséhez kell. Az intakt növény szintetizálja B1 (thiamin) B3 (nikotinsav) B6 (piridoxin) in vitro tenyészetek nem biztos. (minél kisebb, annál kevésbé) eszenciálisak, de főleg a B1 (0,1 – 10 mg/l) H (biotin) PABA (paraamino-benzoesav) C-vitamin antioxidánsként használható (10 - 100 mg/l) mezo-inozit 100 mg/l, cukorszerkezetű vegyület Murashige – Skoog (MS) Gamborg B5 Schenk & Hildebrandt Vitamin Konc. (mg/l) Vitamin Konc. (mg/l) Vitamin Konc. (mg/l) mezo-inozit 100 mezo-inozit 100 mezo-inozit 1000 nikotinsav 0,5 nikotinsav 1,0 nikotinsav 5 piridoxin 0,5 piridoxin 1,0 nikotinamid 0,5 thiamin 0,1 thiamin 10,0 thiamin 5 „Cukrok” - szénhidrátok Cukrok szerepe - szénforrás (sejtépítő anyagok váza), - energiát szolgáltat az organogenezis folyamatához Tenyészet típusa A légzés szubsztrátja AUTOTRÓF a Calvin ciklusban fixált C MIXOTRÓF és HETEROTRÓF a táptalaj

cukortartalma Felhasznált cukor típusa: monoszacharid diszacharid bomlik triszacharid bomlik Raffinóz G, F, galaktóz Glükóz - Szacharóz G, F Fruktóz - Maltóz G Galaktóz - Cellobióz G Mannóz - Trehalóz G Ribóz, Xilóz, Arabinóz - Laktóz G, F Savas környezetben, autoklávozás hatására hidrolizálnak a poliszacharidok. „Cukrok” - szénhidrátok Alkalmazott koncentráció: - általában 0,5-3% (5-30 g/l) - spec. esetekben magas konc (80-100 g/l) Hatásaik: - szabályozás? a vaszkuláris elemek képződésénél - klorofillszintézist gátolják: ALA szintáz blokkolva kevés a porfirinvázas molekula klorofillhiány - fotoszintézis hatékonysága csökken: RuBisCO blokkolódik csökken a CO2 fixálás - megnő az antociánok képződése (pirosas szín – cukortúladagolásra utalhat) - ozmotikus regulánsok a táptalajban cukoralkoholok: szorbitol, mannitol előnyösebbek erre a célra (B-hiány!) Felvételük: részben

passzív permeációval, részben aktív transzporttal aktív transzportnál H+ felvétel, és K+ vagy H+ leadás Táptalajszilárdító anyagok Leggyakrabban alkalmazott zselésítő anyag: agar (tengeri vörösmoszat) Összetétele: poliszacharidok összetett keveréke (galaktóz egységekből álló agaróz és agaropektin láncok) Használata: 0,5-1% koncentrációban (gyártó/tétel függő!) Az agar előnyei: - vízzel gélt képez, ami 100°C-on olvad és ~45°C-on szilárdul meg - az agargélt a növények nem emésztik meg - az agar nem lép reakcióba a táptalaj összetevőivel hátrányai: - nem standard összetételű – tételenként változik - szennyeződéseket tartalmaz - csökkenti a tápanyagok diffúzióját a táptalajban - nehezíti a tápanyagok felvételét az ozmotikus potenciál növelése miatt Táptalajszilárdító anyagok mmol/kg agar 1 agar 2 agar 3 agar 4 agar 5 agar 6 agar 7 agar 8 Gelrite N 53 1 178 100 74 54 2

na na K 2 1 16 9 6 13 2 51 718 Ca 68 41 34 137 66 1 5 2.8 123 Mg 28 24 31 29 48 3 3 2.6 64 Na 202 56 552 330 427 634 114 52 296 P 1 18 1 5 1 40 1 42 68 S 184 78 232 296 204 262 66 184 6 Cl 47 33 220 113 197 95 12 na na Cu 0.015 0.034 0.018 0.024 0.004 0.016 nd 0.005 0.05 Mn 0.073 1.093 0.036 0.173 0.036 0.027 0.055 0.01 0.1 Fe 0.510 5.376 0.564 2.987 0.859 0.599 0.528 0.6 5 Al 0.352 12.444 1.333 4.944 0.352 0.963 0.685 0.3 6.8 Cr 0.040 0.098 0.029 0.026 0.054 0.025 0.009 0.002 0.01 Cd 0.013 0.069 0.008 0.025 0.015 nd nd 0.0002 0.002 Zn 0.092 0.107 0.054 0.933 0.046 0.038 0.015 0.02 0.3 Sn 1.896 1.542 nd 3.572 1.862 nd nd 0.003 0.003 Ni 0.037 0.045 nd 0.037 0.025 nd 0.007 0.005 0.004 B na na na na na na na 2 0.13 Co na na na na na na na 0.0005 1.0 Táptalajszilárdító anyagok Egyéb felhasznált

anyagok: - Agaróz (az agar gélképzéséért felelős összetevője tisztán) 0,4%-ban csak érzékeny protoplaszt és portokkultúrákhoz hajtáskultúránál hiperhidratációt okoz 0,4%-nál 1,5-2%-nál már nem, de ott csökkenti a növekedést - Gelrite™ - gellán gumi (heteropoliszacharid, a Pseudomonas elodea termeli) glükuronsav, ramnóz, cellobióz egységekből álló polimer lánc csak kationok (K+, Ca2+, Mg2+) jelenlétében gélesedik drága, de nagyon tiszta gélt képez nincs benne (annyi) szennyeződés, mint az agarban kisebb koncentráció kell belőle: 0,1-0,3% elegendő egy stabil gélhez - Keményítő (gyenge gélt képez) 5-10% - Zselatin 10%, hátránya, hogy 30°C-on már megolvad, bacik nagyon szeretik - Alginát (nem lehet jól autoklávozni, de jól zselésít) Táptalajszilárdító anyagok 0,15%-os Gelrite gél A táptalaj összetevői - növekedésszabályozók Az in vitro növekedésszabályozás legfőbb tényezői – alapvető élettani

hatásokat fejtenek ki a növényekre Típusaik: - auxinok - citokininek - gibberellinek - egyéb gátló anyagok Hatásukat befolyásolja: - a minőségük - koncentrációjuk - más szabályozók jelenléte/hiánya - a tenyésztett növényi rész genetikai-fiziológiai tulajdonságai Növekedésszabályozó anyagok - auxinok Auxinok – fiziológiai hatás • • • • • • • • • • Sejtek és szervek, elsősorban a szár megnyúlásos növekedésének serkentése Tropizmusok létrejötte A sejtosztódás serkentése citokininek jelenlétében Vaszkuláris elemek differenciálódásának szabályozása Gyökér iniciáció hajtásdugványoknál, gyökérdifferenciálódás szövetkultúrában Meghatározó szerep az apikális dominanciában Levél és termésleválás szabályozása Terméskötés, termésnövekedés, termésérés szabályozása Partenokarpia indukciója Gibberellinekkel együttműködve a virágok nemi jellegének meghatározása (magas

auxin/gibberellin arány nővirágok képződésének kedvez) Közös kémiai tulajdonságaik: • • • Indol vagy aromás gyűrű és egy karboxil-csoport egymástól 0,55 Å távolságra Vízben kevésbé, szerves oldószerekben jól oldódó kristályos anyagok Gyengén savas kémhatásúak Növekedésszabályozó anyagok - auxinok Természetesen előforduló auxinok IES (IAA) 4-klór-IES 2-fenilecetsav IVS (IBA) Szintetikus auxinok 2,4-D NES (NAA) picloram dicamba Növekedésszabályozó anyagok - auxinok Auxinok alkalmazása növekedésszabályozásra in vitro 1. Kalluszindukció egyszikűeknél 2-10 mg/l 2,4-D kétszikűeknél 1-3 mg/l 2,4-D és valamilyen citokinin kiegészítés indukálás után a 2,4-D-t általában NES-re, vagy IVS-re cserélik, mert megnövelheti a szomaklonális variabilitást! 2. Morfogenezis - gyökér és szárképzés 3. Embriogenezis NES vagy IVS használható főként organogenezishez; gyökérképzéshez elég magában

az auxin 1-3 mg/l (0,1-10 mg/l) szárképzéshez magas citokinin:auxin arány szükséges magas 2,4-D koncentrációval indukálunk embriót 1-5 mg/l ezután csökkentjük, különben az embriók nem fejlődnek Növekedésszabályozó anyagok - citokininek Citokininek – fiziológiai hatás: • • • • • • • • Szabályozzák a sejtosztódást, növekedést, fejlődést és differenciálódást Serkentik a sejtmegnyúlást Nem-induktív körülmények között is virágzást válthatnak ki (helyettesíthetik a hidegkezelést, a virágzáshoz azt igénylő növényeknél) Késleltetik a levelek öregedését, serkentik a tápanyagok mobilizálását Apikális dominancia alakítása: az auxin antagonistája, a rügyek képződését serkenti (in vitro körülmények között is) Indukálják enzimek szintézisét Serkentik a kloroplasztiszok érését Elősegítik a gumók képződését Citokininek kémiai szerkezete: • Purinvázzal rendelkeznek, melyen 5 helyen

lehet eltérő szubsztituens - igen változatos és sokféle vegyület tartozik ide, több, mint 200 jelenleg Növekedésszabályozó anyagok - citokininek Természetesen előforduló citokininek 2-iP zeatin Szintetikus citokininek benziladenin (BA) kinetin (KIN) tetrahidropiranil-BA (PBA) thidiazuron (TDZ) Növekedésszabályozó anyagok - citokininek Citokininek alkalmazása növekedésszabályozásra 1. Járulékos hajtásképzés 2. Embriogenezis auxinokkal kombinációban, magas citokinin:auxin arány mellett kétszikűek: alacsony, 0,1-0,5 mg/l koncentrációban auxin mellett egyszikűeknél már 0,0002 mg/l is gátló hatású lehet! 3. Felhasználás hajtáskultúrákban - hónaljhajtások növekedésének serkentése 0,5-10 mg/l - járulékos hajtásrügyképzés - gyökérképződés gátlása – magas, 0,5-10 mg/l koncentrációnál DE: kinetin sok esetben gyökeresedést indukál! 4. Sejtosztódás serkentése kallusztenyészetben alacsony

koncentrációban, 0,1 mg/l, az auxin konc. ~tizede A táptalaj összetevői - növekedésszabályozók Gibberellinek – fiziológiai hatás: •szármegnyúlás serkentése •apikális dominancia erősítése •genetikai és fiziológiai törpeség normalizálása •fény- és hidegigényes magvak csírázásának indukciója •rügyek nyugalmi állapotának megszakítása Gibberellinek – felhasználás a mikroszaporításban •kalluszképzés és fenntartás •morfogenezis gátlása •hajtásmegnyúlás elősegítése GA3 - gibberellin sav A táptalaj összetevői - növekedésszabályozók Auxin-citokinin egymásrahatás AUXIN KONCENTRÁCIÓ magas CITOKININ együttes hatás alacsony gyökérképződés indukálása kalluszindukció egyszikűeknél embriogenezis indukálása járulékos gyökérképzés kalluszból kalluszindukció kétszikűeknél sarjképzés indukálás hajtáskultúránál alacsony magas Növekedésszabályozó anyagok - egyéb •

Abszcizinsav: alacsony konc. 0,1-1 mg/l esetén serkentheti a kallusznövekedést, magasabb konc. >1 mg/l esetén gátolja azt • Etilén: gátolja a sejtosztódást és a morfogenezist, jelenléte nem kívánatos • Anti-gibberellinek (gibberellin-antagonisták): klórmekvát (CCC), ancymidol, paclobutrazol – növelik a szárazanyagtartalmat, erősítik a hajtásokat, törpésítenek, csökkentik a hiperhidratációt • Anti-auxinok: trijód-benzoesav, transz-fahéjsav – az auxin hatását reverzibilisen gátolják (nem kívánt kallusznövekedés) • Fenolvegyületek: phloroglucinol – antioxidáns, csökkenti a vitrifikációt, antibakteriális Természetes eredetű kivonatok Könnyezési nedvek: - komplex összetétel: aminosavak, vitaminok, cukrok, makro- és mikroelemek, hormonok - nem standard, változó összetétel! Acer, Juglans, Cladrastis könnyezési nedvei Terméskivonatok: Kókusztej(-víz), banánkivonat, paradicsomlé, burgonyapép, csicsóka

Élesztő és húskivonatok – aminosavaknál már volt róluk szó Táptalajok elkészítése Törzsoldatok készítése Makroelemek Fe nélkül, 10-20x Törzsoldatok összemérése desztillált vízbe Cukor hozzáadása Fe-EDTA 0,5g/100ml Makroelemek külön 10g/100ml Mikroelemek 1000x Vitamin törzsoldat 100x Hormonok 0,1-1 mg/ml Feltöltés végtérfogatra pH beállítása Táptalajszilárdító hozzáadása Környezeti tényezők a tenyésztés során - Megvilágítás Környezeti tényezők a tenyésztés során – Hőmérséklet A növényi szövetdarabok, explantátumok nem tudnak úgy védekezni a hőmérsékletingadozás ellen, mint az intakt növény! a legtöbb kultúra számára optimális az átl. 25 °C (17°-32°C) trópusi és szubtrópusi növényeknek az átl 28 °C (24°-32°C) (pl citrusfélék, rizs, gyapot, Bougainvillea) sötét periódusban 4-5°C-kal alacsonyabb hőmérséklet a hőmérséklet hatással van a citokininek aktivitására

– magas hőmérsékleten csökken majd megszűnik - föld alatti szervek (hagymák, gumók) in vitro organogenezisére is nagy hatással van a hőmérséklet – konstans hőm. esetén jobb ezen szervek képződése mérsékelt égövi fás növények in vitro kultúrája 4-5°C-on, sötétben jól tárolható néhány hónapig (alma, körte, berkenye) magas hőmérséklet (38°C) vírusmentesítésre alkalmas Környezeti tényezők a tenyésztés során - Tartóedények A mikroszaporítás gazdaságossági vonatkozásai  Nagyléptékű szaporítás – feltételek megléte  Technikai feltételek – technológiai feltételek  Sikeres kísérlet ≠ technológia !!!  Teljesítménymutatók – a termelési folyamat jellemzése: • kultúránként eltérő teljesítményadatok • Kioperálható merisztémák száma 30-200 db/ 8 óra • Gerbera sarjcsokrainak feldarabolása: 800-1100 db / 8 óra • Nóduszkultúrás szaporítás: 1200-1800 db / 8 óra • Fás

szárú növényeknél 20-50%-kal kisebb mutatók • Több fajta – 20-30%-kal kisebb mutató A mikroszaporítás gazdaságossági vonatkozásai Önköltség: • Európában a 60-65%-át a bér és járulékai teszik ki • Nem tartozik a jól fizetett tevékenységek közé  elvándorlás Virológiai vagy egyéb tesztelést nem igénylő ex vitro növény önköltségének az alakulása: Szűkített önköltség + egyéb költségek Bér 42% Általános költségek (15-25%) Közterhek 18% ÁFA Energiaköltség 15% Licencdíj: Amortizáció 5% szegfűnél 0,019 €/db Anyag 10% krizantém: 0,0067-0,012 €/db Kutatás-fejlesztés + PR 10% gerbera: 0,15-0,20 €/db Összesen 100% A mikroszaporítás gazdaságossági vonatkozásai Terméktípusok: • Nem gyökeres hajtások vagy sarjcsokrok (minidugványok) • Gyökeresített, de nem akklimatizált in vitro növény • Akklimatizált, közegbe ültetett növény (lyuktálcás) • Gumók, hagymák

– közvetlenül közegbe ültethető Néhány ár Betula pendula ‚Purpurea’ 1,15 €/db (72-es tálca), 2,06 € (6-os cserép) Syringa vulgaris fajták 0,76 €/db (72-es tálca) Rózsa, klemátisz fajták 1,07 €/db (72-es tálca) Hosta fajták 0,76 €/db (72-es tálca) Vírustesztelt Gerbera fajták 2,05 €/db Spathiphyllum fajták 0,3-0,6 €/db (162 vagy 72-es tálca) A mikroszaporítás gazdaságossági vonatkozásai Törzsállomány céljára előállított ex vitro növény: • Többször tesztelik - meghatározó költségtényező • ELISA teszt egy vírusra vásárolt diagnosztikummal: 200-400 Ft/minta • ELISA teszt egy vírusra saját készlettel: 35-50 Ft/minta • PCR teszt egy nagyságrenddel drágább, mint a vásárolt készlettel végrehajtott ELISA teszt A mikroszaporítás gazdaságossági vonatkozásai A költségek csökkentése: • Automatizálási lehetőségek • Új(ragondolt) technikák alkalmazása RITA tenyésztési rendszer

A mikroszaporítás gazdaságossági vonatkozásai ForBio Vitron 501 mikroszaporító robot Elektromos-pneumatikus és mechanikus konstrukció Gyökeres, egy hajtással rendelkező növényeket állít elő (nóduszkultúra) Éves teljesítménye: 15 millió növény (eukaliptusz, akác, tikfa) Egyéb automatizált rendszerek: átfolyós táptalajsterilizáló és töltő A mikroszaporítás gazdaságossági vonatkozásai Fotoautotróf mikroszaporítás • Szénforrás a levegő szén-dioxidja • Cukormentes táptalaj – minimális a kontamináció • Erőteljesebb növekedés • Könnyebb akklimatizálhatóság Bioreaktor rendszerek Gerbera mikroszaporítása A – anyanövény B – merisztémák C – merisztémák D – endogén baci E – felszaporítási fázis F – osztás előtt G – osztás után H – gyökeresedés I – kész in vitro növény J – akklimatizálás K – 4 hónap múlva MS táptalaj + 1-3 mg/l BA / KIN 0,1-0,5 mg/l IES / NES

Afrikaiibolya mikroszaporítása A – regeneráció levéllemezen B – sz. embriók C – sz. embrió D – fejlődő hajtások E – tőlevélrózsa F– -”G – kész növény H – akklimatizálás I – mutáns egyed MS táptalaj + 0,2-0,3 mg/l BA / NES 0,1 mg/l TDZ Köszönöm a figyelmet!